第３６卷第３期 ２０１４年３月 中国预防兽医学报 Ｖｏ１．３６．Ｎｏ．３ Ｍａｒ．２０１４ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８—０５８９．２０１４．０３．１６ 鸡自然杀伤细胞的分离与免疫表型分析 杨 超 ，张晓娜 ，张园华 ，廉传江 ，文辉强 ，陈洪岩 ，韩凌霞 （１．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／实验动物与比较医学团队，黑龙江哈尔滨１５０００１； ２．山西农业大学动物科技学院，山西太谷０３０８０１） 摘要：为研究鸡自然杀伤（ＮＫ）细胞，本实验采用冷胰酶消化法消化１４日胚龄鸡胚脾脏组织，分离收获鸡 胚脾脏淋巴细胞，在含有重组鸡白介素．２和条件培养基的ＩＭＤＭ培养液中培养４８ ｈ，收获悬浮细胞，暂时命名 为ＴＣＲ０细胞（即鸡ＮＫ细胞）。流式前向角和侧向角分析显示培养的ＴＣＲＯ细胞中８５．１％的细胞大小均一，颗粒 度一致；瑞氏吉姆萨染料染色结果表明ＴＣＲ０细胞内一侧含有嗜酸性大颗粒，符合鸡ＮＫ细胞的形态特征；流式 细胞术单克隆抗体染色结果显示，ＴＣＲ０细胞中，９７．４％高表达ＭＨＣ Ｉ类分子，３０．８％低表达ＣＤ８ａ，不表达Ｔ 细胞表面标记ＣＤ３和Ｂ细胞表面标记ＣＤ４和Ｂｕ．１，符合鸡ＮＫ细胞表面标记特点。本实验是国内成功分离并纯 化鸡ＮＫ细胞的首次报道。 关键词：鸡自然杀伤细胞；分离与培养；免疫表型 中图分类号：￥８５２．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８．０５８９（２０１４）０３—０２３６—０３ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ＹＡＮＧ Ｃｈａｏ ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｎａ ，ｚＨＡＮＧ Ｙｕａｎ—ｈｕａ２，ＬＩＡＮ Ｃｈｕａｎ－ｊｉａｎｇ ， ＷＥＮ Ｈｕｉ—ｑｉａｎｇ ，ＣＨＥＮ Ｈｏｎｇ—ｙａｎ ，ＨＡＮ Ｌｉｎｇ－ｘｉａ （１．Ｕｎｉｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｒｂｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｕｒａｌｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａ￣ｉｎ １５０００１，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ ０３０８０１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ＮＫ（ｃｈＮＫ）ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｌａｇｇｅｄ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｌａｃｋ ｏｆ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｃｈＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｕｒｅ ｆｔｏｒ ｃｈＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｐｌｅｅｎ ｉｎ １４ ｄａｙ ｏｌｄ－ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｓ ａ ｒｉｃｈ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｃｈＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｐｌｅｅｎｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｌｄ ｔｒｙｐｓｉｎ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＩＭＤＭ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｈｉｃｋｅｎ ＩＬ一２ ｆｏｒ ４８ ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ，ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌｌｙ ｎａｍｅｄ ＴＣＲ０ ｃｅｌｌｓ（ｃｈＮＫ ｃｅｌｌｓ），ｗｅｒｅ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ ａｎｄ ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ８５．１％ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ Ｗｒｉｇｈｔ—Ｇｉｅｍａｓ’ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｓｓａｙ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｌａｒｇｅ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｉｎ ｏｎｅ ｓｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｉｌｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｃｈＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｃｈＮＫ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｕｎａｂｌｅ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ＣＤ３，ＣＤ４ ａｎｄ Ｂｕ－１，ｗｈｅｒｅａｓ，ｔｈｅ ９７．４％ｏｆ ＴＣＲ０ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｒｉｇｈｔｌｙ ｆｏｒ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ３０．８％ｄｉｍｌｙ ｆｏｒ ＣＤ８ａ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｗｅ ｈａｖｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｕｒｅ ｃｈＮＫ ｃｅｌｔｌｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｃｋｅｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ；ｉｒｎｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ 木Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ 收稿日期：２０１３．０４—２３ 基金项目：国家自然科学基金项目（３１１０１８００）；科技部支撑项目（２０１３ＢＡＫ１１Ｂ０２） 作者简介：杨超（１９８８一），男，四川成都人，硕士研究生，主要从事免疫遗传学研究 通信作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｌｘ１９９３＠１２６．ｃｏｍ 第３期 杨超，等．鸡自然杀伤细胞的分离与免疫表型分析 ２３７ 自然杀伤（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ，ＮＫ）细胞是一类大颗粒 淋巴细胞，具有先天性免疫细胞和适应性免疫细胞 的特点【”。因为未鉴定出鸡ＮＫ细胞的特异性表面 标记一哺乳动物ＮＫ细胞的表面标记不适用于鸡 ＮＫ细胞，目前人们对鸡ＮＫ细胞知之甚少。根据 鸡胚免疫细胞的发育，１４日胚龄鸡胚脾脏中没有Ｔ 细胞和Ｂ细胞，是鸡ＮＫ细胞最富集的区域，脾脏 中的淋巴细胞曾经被命名为ＴＣＲ０细胞，后来被证 明是鸡ＮＫ细胞 。 鸡ＮＫ细胞与多种禽病原体的致病性密切相关口１。 尽管国内对ＮＫ细胞的研究逐渐增多，但基本集中 于人和小鼠『４】，对鸡ＮＫ细胞的系统研究比较少。 本实验室参考国外最新研究进展，在国内首次建立 了鸡ＮＫ细胞的分离纯化方法，并通过形态学和免 疫表型的研究证明成功分离培养及鉴定了鸡ＮＫ细 胞，为系统研究鸡ＮＫ细胞奠定了基础。 １ 材料和方法 １．１ 实验动物１４日胚龄ＳＰＦ鸡胚由本所实验动 物中心提供。许可证编号为ＳＣＸＫ（黑）２０１ １－００７。 １．２主要试剂和仪器刀豆素Ａ（ＣｏｎＡ）购自Ｓｉｇｍａ 公司，ＰＥ标记的鼠抗鸡ＣＤ３（ＣＴ．３）、ＣＤ４（ＣＴ．４）、 ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ（Ｆ２１．２）及ＦＩＴＣ标记的鼠抗鸡ＣＤ８ａ （ＣＴ．８１和Ｂｕ．１（ＡＶ２０）等单克隆抗体（ＭＡｂ）购自 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。鸡淋巴细胞分离液购 自天津市灏洋生物制品科技有限公司。ＩＭＤＭ和鸡 血清等购自ＧＩＢＣＯ公司，鸡重组白介素．２（ｒｌＬ．２）购 自Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ公司。３０ １（ｕ超滤管和ＦＡＣＳ Ａｒｉａ型流 式细胞仪分别为ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ和ＢＤ公司产品。 １．３条件培养基的制备参照文献［５］的方法，无 菌取健康成年鸡脾脏，３００目铜网研磨破碎，采用 鸡血淋巴细胞分离液分离获得脾脏淋巴细胞，用 ＰＢＳ洗３遍，最后沉淀用ＩＭＤＭ按浓度１×１０６／ｍＬ重 悬，在３７℃５％ＣＯ２培养２ ｈ，按终浓度１０￣ｇ／ｍＬ 加入ＣｏｎＡ。培养４８ ｈ收获细胞培养物，２５０ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，将上清转移到３０ｌ（ｕ超滤管，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ，收获下层液体，即为条件培养液。分 装，置．７０℃备存。 １．４鸡胚ＮＫ细胞的制备无菌取３０枚１４日胚龄 鸡胚脾脏，以ＰＢＳ冲洗，采用５ ｍＬ含０．２５％胰酶 的ＩＭＤＭ溶液中，４℃消化ｌ２～１６ ｈ。弃胰酶消化 液，加入１ ｍＬ ３７℃预热的含０．２５％胰酶的ＩＭＤＭ 继续消化。过量ＰＢＳ终止｝肖化。利用鸡淋巴细胞分 离液分离鸡胚脾脏淋巴细胞，ＰＢＳ洗３次。沉淀按 １×１０６／ｍＥ加入完全培养基（１０％条件培养基，８％ ＦＢＳ，２％鸡血清，３ ｎｇ／ｍＬ ｒｌＬ－２）。３７℃５％ＣＯ２ 培养４８ ｈ。收获悬浮细胞，暂时命名为ＴＣＲ０细胞。 １．５瑞氏吉姆萨染色按照瑞氏吉姆萨染色说明 书染色。取１．４中制备的１ ｘ１０ 个细胞，ＰＢＳ洗２ 次，用１００ Ｌ固定液（甲醇：冰乙酸＝１：３）重悬，固 定１５ ｍｉｎ。每张载玻片滴加５０ Ｌ，自然风干，蔡 司光学显微镜（８０ｘ１０放大倍数）下观察记录。 １．６鸡ＮＫ细胞免疫表型的流式细胞术分析取 １．４中制备的鸡ＮＫ细胞，台盼蓝溶液染色，血细胞 技术法计算活细胞浓度，调整细胞浓度至１ ｘ１０ 个 ／ｍＬ。ＰＢＳ洗２次。取３００ ＩｘＬ细胞，分别加入１ ｔｘＬ ＰＥ标记的ＣＴ．３、ＣＴ．４和Ｆ２１．２，以及ＦＩＴＣ标记的 ＡＶ２０和ＣＴ一８，单染，同时将未加任何抗体标记的 鸡ＮＫ细胞作为阴性对照，相同处理。室温孵育 ３０ ｍｉｎ，过量ＰＢＳ终止反应，洗３遍。最后加入 ３００ ＩｘＬ ＰＢＳ重悬，立即通过ＦＡＣＳ Ａｒｉａ流式细胞仪 检测。或加入３００ ＩｘＬ １％多聚甲醛重悬，４℃固定。 利用ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ软件获取数据，采用Ｆｌｏｗｊｏ 分析 ２ 结 果 ２．１ 鸡ＮＫ细胞的形态学鉴定利用流式细胞仪检 测培养的ＴＣＲ０细胞。流式前向角（Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ， ＦＳＣ）和侧向角（Ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ，ｓｓｃ）分析显示，ＴＣＲ０ 细胞中８５．１％的细胞大小均一，胞内颗粒分布一致 （图１）。瑞氏吉姆萨染色表明，分离的ＴＣＲ０细胞为 大颗粒淋巴细胞，其中细胞核位于一侧，嗜酸性颗 粒位于细胞内另一侧，符合ＮＫ细胞特征（图２）。 ２．２鸡ＮＫ细胞免疫表型鉴定采用流式细胞术和 表型ＭＡｂ对ＴＣＲ０细胞染色。结果显示，ＴＣＲ０中， ＭＨＣ Ｉ高表达，占９７．４％，表明分离的细胞状态良 好，表型完整；ＣＤ８ａ低表达，占３０．８％；而Ｔ细 胞表面标记ＣＤ３染色为阴性；Ｂ细胞的标记ＣＤ４ 和Ｂｕ．１染色均为阴性（图３）。实验结果表明，分离 培养的ＴＣＲＯ细胞状态良好，符合鸡ＮＫ细胞标记 特征。